高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography /HPLC）是色譜法的一個重要分支，通過高效、快速的分析分離，可識別、量化和純化混合物中的單個成分，廣泛應用于醫藥、環保、石化、食品、化工等行業，是現代分離測試的重要手段。色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(station phase)發生作用（吸附、分配、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出，又稱為色層法、層析法。

色譜法分析示意圖

高效液相色譜法以經典的液相色譜為基礎，以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有顆粒極細的高效固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。高效液相色譜法的應用范圍十分廣泛，對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發性和熱穩定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點、極性、離子型化合物和大分子物質均可用高效液相色譜法分析測定，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。

高效液相色譜柱

而高效液相色譜的實際使用中，色譜柱是色譜分離的核心，這與色譜基質填料息息相關。高效液相色譜的基質材料包括填料和整體柱材料，填料可分為無機基質填料和有機基質填料，無機基質填料包括硅膠、氧化鋁、氧化鋯、羥基磷灰石、氮化物以及活性碳等。此外還有復合物材料，即通過精細調控技術制備的無機-有機球雜交基球，經化學衍生后，制備得對藥物分析和篩選很有用的高效、可耐pH2～8、低吸附性的新型填料。

色譜柱及色譜填料示意圖

按固定相和分離機理，高效液相色譜技術可分為許多種類，不同的分離機理需要不同的色譜基質材料。

高效液相色譜法的分類

其中，在吸附色譜中，硅膠、氧化鋁、活性炭和聚酰胺應用最為廣泛。其中活性炭柱色譜尤其適用于分離水溶性物質，如氨基酸、糖類以及某些苷類，它是分離水溶性物質的主要吸附材料之一。色譜分離和分析性能很大程度上取決于色譜填料，現代的色譜填料基本都是由微米級多孔微球組成，就像芯片是電子產品的心臟一樣，色譜填料當之無愧是整個色譜分離技術的“心臟”，因此被譽為色譜芯。縱觀幾大分離色譜，大多數具有特異分離效果的色譜材料均是復合型色譜填料，其中無機填料的應用十分常見。

基質填料種類

1.硅膠（二氧化硅）

無機基質材料中最重要的是硅膠(xSiO₂·yH₂O)，微粒型硅膠的出現，促進了高效液相色譜法的發生與發展。用作色譜填料基質的硅膠是通過人工合成的，其制備方法多樣，大都擁有各自的專利。合成色譜用硅膠區別于天然晶體二氧化硅，也區別于介于晶型和無定型之間的用于色譜、電色譜中的石英毛細管，用作色譜填料的是無定型二氧化硅。

由二氧化硅材料組成的色譜材料是分析檢測最廣泛使用的色譜填料，也是多肽、胰島素、手性藥物等分離純化最常用的色譜填料。通常，250目~400目（即40μm~63μm直徑）的硅膠顆粒的含水量直接影響活性，其活性隨著含水量的升高而降低。當其含水量接近20%的時候，硅膠基本不具吸附活性；活性太高則出現不可逆吸附和拖尾，甚至分離物分子結構的改變。

硅膠色譜填料發展歷程

硅膠能用于色譜基質材料,是因為其表面具有重要的活性基團硅羥基,即自由硅羥基,或稱孤立硅羥基。由于游離的硅羥基是造成色譜峰尤其是堿性溶質拖尾的主要原因，因此在合成反相色譜材料中，針對硅羥基的封尾技術非常重要，即需要一定的表面修飾。

色譜硅膠表面硅羥基示意圖

對硅膠表面進行的改性是通過該活性基團進行的，通過各種硅烷化試劑對硅膠表面進行修飾，可以得到包括烷烴和芳烴在內的烷基反相填料。常用的硅烷化試劑除了氯硅烷和烷氧基硅烷外，還有烷基硅氨烷。例如以氨基、羧基、磺酸基修飾，可得到離子交換填料；以聚乙二醇修飾，可得到疏水作用的填料。對于化學鍵合相硅膠，在孔徑、粒徑相當的前提下，穩定性是其最重要的指標，這與鍵合反應的條件控制有關。另外，硅膠的預處理過程對最終硅膠基質填料的穩定性也有十分重要的影響，在預處理過程中，需要無機酸浸泡，以除去硅膠表面存在的會造成峰型拖尾，甚至不可逆吸附強極性雜質的Na⁺、Ca²⁺、Al³⁺、Fe³⁺等金屬離子。

硅膠表面修飾

2.氧化鋁

用作吸附材料和色譜填料基質的氧化鋁主要是γ-氧化鋁，γ-氧化鋁表面化學修飾比硅膠更困難，因此氧化鋁多使用于一些小分子有機化合物的分離，用于正相、

離子交換色譜和反向高效液相色譜中，在生化分離上應用得少。

γ-氧化鋁

氧化鋁的化學修飾可通過鋁羥基的反應或是涂覆技術。

通過鋁羥基反應可通過在氧化鋁表面上的活性羥基鍵合C4、C8和C18等烷基，制得在寬pH范圍內穩定，應用于反相色譜中的烷基化氧化鋁。表面涂覆可以制得聚苯乙烯-二乙烯基、聚丁乙烯或十八烷基硅烷等強疏水性復合材料。

在吸附型制備色譜中，氧化鋁的吸附能力比硅膠更強，氧化鋁比硅膠的樣品處理量更大，根據含水量大小(0%~15%)，大多情況下，需要控制的含水量為6%~10%，

對應的活性為第三和第四等級。根據酸堿性，應用于吸附色譜中的氧化鋁分為中性、酸性和堿性氧化鋁，中性氧化鋁水提取液的pH值為7.5，適用于醛、酮、醌、某些苷及酸堿溶液中不穩定化合物，如酯、內酯等化合物的分離，因此應用十分廣泛。大多數情況下使用的是堿性氧化鋁，水提取液的pH值為9～10，常應用于碳氫化合物的分離，能中碳氫化合物中除去含氧化合物，還能對某些色素，甾族化合物、生物堿、醇以及其他中性、堿性物質的分離。酸性氧化鋁水提取液的pH值為4～4.5，適用于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分離。

典型層析活性氧化鋁技術指標

3.氧化鋯

氧化鋯和硅膠一樣，具有優異的機械強度，適宜的孔結構和可用于鍵合其他功能基團的活性位點外，還具有更寬的pH耐受范圍和更好的耐溫性。

氧化鋯多孔小球可耐受pH 0~14的環境，可高達900℃的溫度下長時間工作不會變形且結構不遭受破壞；碳十八鍵合二氧化鋯（ODZ）可在pH 2~12范圍內使用；聚丁二烯包覆二氧化鋯復合填料在全pH值范圍內穩定，并且能耐200℃的柱溫。

單分散多孔二氧化鋯色譜填料

4.復合型填料

硅膠基質化學鍵合相在pH 2~8的范圍內穩定，難以耐受更寬的pH范圍，在堿性條件下硅膠基質會發生溶解，于是人們將機械強度較低、在有機溶劑中易發生溶脹的高聚物引入到硅膠基質填料中，與硅膠形成優勢互補，制備出有機-無機復合型填料，即包覆型填料或涂覆型填料。

硅膠、氧化鋁、氧化鋯等都可用作包覆型填料的基質材料，其中最重要的是硅膠和氧化鋯。用于包覆無機基質填料的高聚物則有聚苯乙烯、聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯、聚丁二烯、聚環氧乙烷、聚硅氧烷、瓊脂糖、聚氯甲基苯乙烯-二乙氧基甲基乙烯基硅烷以及氣相沉積碳等。

早期包覆型填料的制備采用物理包覆法，制得的復合物孔徑結構不甚可控，重現性差，后期采用的是化學鍵合或復合型包覆法。

化學包覆法首先利用無機基質表面修飾技術使硅膠、氧化鋁或氧化鋯等基質的表面帶上適合數量的活性基團，例如可發生加合反應的雙鍵、環氧基團、氨基或羧基等，再將制備高聚物所需的單體、交聯劑等涂覆到基質表面，然后通過加入引發劑，控溫等條件引發化學鍵合或共聚反應，制得包覆層緊密牢固的復合色譜填料。但是由于聚合物包覆不完全，會影響吸附效果，可以通過有機物熱蒸汽化學氣相沉積法使熱解碳對裸露無機基質進行包覆。

聚合物包覆填料優勢

基質填料的性能表征

對于液相色譜而言，色譜柱最重要的參數主要有粒徑及粒徑分布、孔徑及孔徑分布、比表面積以及比孔容、表面形貌、柱效、滲透性及柱壓耐受性等物理及表面性質；而化學性質則主要包括基質填料功能基團的結構解析及鍵合量。

1.物理及表面性質的表征

填料的表面形貌、粒徑形狀大小及粒徑分布主要通過高倍數的掃描電鏡進行觀測，掃描電鏡圖是優化填料合成條件強大的直觀評價依據；孔徑分布和比表面積一般可通過氮吸附法測定，了解基質材料在微孔、中孔及大孔范圍內的孔徑分布。

擴展閱讀：

1.掃描電鏡在納米材料研究中的應用

2.粉體比表面積測試方法對比分析及應用領域

2.化學性質的表征

對于大多數液相色譜填料的功能基團，在中紅外、遠紅外及近紅外的指紋區都有相應的特征吸收，因此，可通過紅外光譜對其進行結構解析。傅里葉紅外光譜在合成填料過程中，通過比較鍵合前后基質的紅外光譜，判別鍵合試驗是否成功。

以反相色譜柱為例，填料通常通過其含碳量來表征表面化學修飾的程度。高效液相色譜柱填料的含碳量在百分之幾到百分之二十幾之間，現代元素分析儀可測定化學鍵合硅膠中碳、氫和氧的含量。對于表面由單分子層修飾的基球，可通過含碳量及填料的比表面積計算修飾基的密度，進而對不同填料進行比較。

不同修飾基填料

近年來，固體核磁共振波譜技術也應用于高效液相色譜固定相中，例如在無機基質表面鍵合C18制備反相色譜柱中，用13C標記C18修飾基團，可通過核磁共振信號判別13C標記苯環修飾基團是否交聯到無機基質表面。

參考來源：

1.液相色譜柱基質材料的發展，黃遠麗（工程技術）；

2.《從中國色譜“芯”崛起看中國電子“芯”的希望》，江必旺（蘇州納微科技有限公司）。

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