1  引  言

   磷脂( Phospholipids，PLs)是含有磷酸的脂類，它為兩性分子，一端為親水的含磷酸基團的極性頭基，另一端為疏水的含有兩條長脂肪酸鏈的非極性尾部。磷脂是生物體內細胞膜的重要組成部分，在細胞信號傳導和細胞凋亡方面發揮著重要作用，它也與許多疾病的發生有關，可作為某些疾病的信號分子。磷脂分為兩大類：甘油磷酯類和鞘脂類，甘油磷脂又分為卵磷脂、腦磷脂、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇等，所以磷脂的種類繁多。

 基于磷脂結構的復雜性和多樣性，磷脂分析是一個挑戰。常用的有薄層色譜法( TLC)、核磁共振( NMR)、質譜(MS)、氣相色譜．質譜聯用(GC-MS)和液相色譜．質譜聯用(LC-MS)等技術。TLC法靈敏度和分辯率都較低，且易引起磷脂的氧化和分解；CC-MS不適合于直接分析磷脂，因為磷脂沒有揮發性，需要經水解、甲酯化等處理；3lp_NMR可利用磷原子3lp來分析各種磷脂，但NMR法的靈敏度較低，僅限于磷脂酰膽堿等組織中含量較高的磷脂樣品的測定；MS法，特別是電噴霧質譜(ESI-MS)是目前磷脂分析中應用最多的軟電離法，ESI-MS法前處理簡單，分析時間短，不足之處在于難以分析豐度較低的磷脂。在此基礎上，Han等又開發了基于源內分離的“鳥槍法”和多維質譜法測定磷脂和其他脂質分子。HPLC-ESI-MS具有高分辨率、高靈敏度和特異性強等優點，是磷脂分析的較好工具，但儀器價格昂貴。蒸發光散射檢測器（Evaporative light scattering detector，ELSD）作為一種新型通用型檢測器，它價格便宜，且無TLC和GC-MS分析磷脂的缺點，在分析過程中不易引起磷脂的氧化和分解，適合直接分析磷脂，在磷脂分析中具有很好的可行性。

   在生物樣品中磷脂種類繁多，結構復雜，低豐度檢測困難，且干擾較多。如果在應用上述方法分析前，先對磷脂進行選擇性提取，對于體內的磷脂分析，特別是對發現一些微量的信號分子是很重要的。常用的磷脂提取方法有甲基叔丁基醚( Methyl tert-butyl ether，MTBE)液．液萃取法和固相萃取法(SPE)。SPE比較常用的是氨丙基、氨基或二醇基修飾的硅膠等正相材料，但這些方法選擇性普遍不高。

   金屬氧化物（如Zr02等）由于具有路易斯酸一堿的特性，在酸性條件下可以與帶有磷酸基團的物質結合，達到與其它物質分離的目的，在堿性條件下洗脫則可達到富集的目的，故金屬氧化物選擇性富集磷脂是非常有前景的方法，但Zr02本身存在比表面積小，顆粒粒徑小，不適合做SPE填料等缺點。本研究采用NH3/H2O內部水解法，將Zr02負載在球形硅膠微球之上，制成核殼型Zr02/Si02顆粒，并填充為SPE小柱，用于選擇性富集磷脂，并采用RPLC-ELSD進行評價。結果表明，本研究獲得的核殼型Zr02/Si02顆粒具有良好的富集效率，在生物樣品分析中有很好的應用前景。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

   Shimadzu LC-20AB高效液相色譜儀（日本島津公司）；ELSD-UM3000蒸發光散射檢測器（上海通微分析技術有限公司）；XW-80A漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；飛鴿牌TCL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；BrI224S電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；Molatom1805a摩爾原子型超純水器（重慶摩爾水處理設備有限公司）；S-4800場發射掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司），Lambda 950紫外可見近紅外分光光度計（美國）；C。反相高效液相色譜柱（250 mm x4.6 mm．5ym，蘇州環球色譜有限公司）；

   溶血磷脂酰膽堿(1 -Palmitoyl-2 -hydroxy-sn-glycero -phosphocholine，lyso-PC( 16：0))，溶血磷脂酰膽堿(1 -Stearoyl-2 -hydroxy-sn - glycero_3 -phosphocholine，lyso-PC( 18：0))，磷脂酰膽堿（1，2-Dimyristoyl-sn -glyce-ro-3 -phosphocholine，DMPC），磷脂酰乙醇胺(1-Palmitory-2 -oleoyl-sn-glycero-3 -phosphoethanolamine，POPE)，磷脂酰膽堿（1-Palmitory-2 -oleoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine，POPC）均購于美國Avanti PolarLipids公司；乙酸銨（國藥集團化學試劑有限公司）；20 um球形硅膠（蘇州環球色譜公司）；ZrOCl2．8H20（上海阿拉丁試劑有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，上海星可生化有限公司）；異丙醇、正己烷（色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司）；氯仿（分析純，國藥試劑有限公司）；氨水（分析純，平湖化學試劑廠）。

2.2實驗方法

2.2.1    Zr02/sio2填料制備采用NH3/H20內部水解法，制備二氧化鋯包覆的二氧化硅核殼結構填料。過程為：采用相當于3. 5%（Zr02/Si02，w/w）的ZrOC12.8H20水溶液多次浸潤20 um球形硅膠，并在60℃不斷攪拌直至干燥；在100℃下干燥6h，將ZrOCl2負載的Si02放置進14%氨水環境中，在60℃下水浴約4~6 h，然后在500℃馬弗爐內煅燒數小時，即得到3. 5%（Zr02/Si02，w/w）包覆的Zr02/Si02核殼型材料。7% Zr02/Si02( w/w)核殼型材料制備方法與上相似。本實驗中所用Zr02對照材料由ZrOCl2.8H20直接煅燒得到。

2. 2.2固相萃取步驟將30 mg Zr02/Si02顆粒裝填在1 mL SPE小柱內，SPE小柱的頂部和底部分別放入聚丙烯篩板。取150 uL磷脂標準品或者血漿磷脂提取物，溶解在300 uL含1%甲酸的正己烷一異丙醇(2:8，v/v)溶液內，加入到Zr02/Si02填充的SPE小柱中，平衡后回收流出液，記為流出液(No bindingsolution)；用300 uL正己烷一異丙醇(2:8，wv)溶液清洗SPE小柱，回收清洗液，記為清洗液(Washingsolution)；分別用300 uL 7 mol/L氨水一甲醇溶液洗脫，共3次，合并洗脫液，記為洗脫液(Elution)。

   而對于Zr02，上樣、清洗和洗脫步驟同上述SPE方法相同。只是采用離心的方法，渦旋4 min，靜置4 min，10000 r/min離心5 min，取上清液。得到流出液、清洗液和洗脫液后，揮干，分別用150 uL甲醇復溶，備用。

2.3    HPLC-ELSD分析

   C8色譜柱(250 mm x4.6 mm，5um)，流動相A:甲醇一水(80:20，V/V）溶液含10 mmol/L乙酸銨，流動相B：甲醇含10 mmol/L乙酸銨。流速：l mUmin，梯度條件：0—15 min，500-/o~100%B；15 ~30 min，100%B。ELSD檢測器條件：蒸發溫度：45℃，霧化氣體：空氣，載氣流量：2.5Umin，載氣壓力：322 kPa。

2.4血清樣品的制備

   健康人血清樣品來自瑞金醫院志愿者。血清樣品中脂質的提取方法為：取血清樣品400 uL，加入3 mL甲醇，超聲60 s，加入3 mL氯仿，超聲60 s，在室溫中靜置30 min，加入1.5 mL水，使之分層，1500 r/min離心10 min，取下層有機層，在25℃揮干，并用4 mL含1%甲酸的正己烷一異丙醇(2:8v/v)混合溶液復溶，4℃保存至進樣。

2.5 UPLC-Q-TOF分析

   采用2.2.2節的方法提取的血清中的脂質，經過SPE處理為流出液、清洗液和洗脫液，并分別進UPLC-Q-TOF分析。UPLC C8色譜柱（100 mm×2.Imm，1.7um，美國Thermo Fisher公司）及UPLC18保護柱（5 mm×2.1 mm，ASQUITY UPLC-TM，美國Waters公司），柱溫為40℃，流速0.4mL／min，流動相同2.3節，梯度為：0-3 min，1% -50%B，3-7 min，50% -100%B，7-15 min，lOOqoB，正離子模式，進樣量為2uL，以氮氣作為霧化氣，飛行管檢測模式V型，毛細管電壓（Capillary voltage）3 kV，錐孔電壓(Sampling cone) 35 kV，離子源溫度(Source temperature) 110℃，脫溶劑氣溫度(Desolvation temperature)300℃，反向錐空氣流(Cone gas flow) 50 L/h，脫溶劑氣(Desolvation gas flow) 600 L/h，萃取錐孔( Extraction cone)4 V．離子掃描時間(Scan time)0.03 s，掃描時間間隔(Inter scan time)0.02 s，數據采集范圍為m/z 50—1500。

3結果與討論

3.1 ZrOz/Sio2核殼型填料的制備和表征

   在本實驗中采用NH3/H2O內部水解法，并用ZrOCl2·8H20替代Zr0( N03)2·2H20，制備了Zr02/Si02核殼型填料。從圖可見，Zr02/Si02與Si02形態較為一致，但外表略感粗糙，初步說明在Si02上包覆了Zr02。采用紫外可見漫反射光譜( UV-visible diffuse reflectancespectra)進行固體樣品顆粒掃描，包覆有3.5%和7%的Zr02/Si02核殼型填料的吸收光譜與核Si02的吸收光譜有所不同，核殼型填料在300—400 nm相比純Si02有較強的吸收峰，且包覆比例越高，吸收峰增強越多；另外在2r02可以看到206和230 nm兩個吸收峰，其中206 nm是處于四面體結構中的Zr4+_02-之間的電子轉移躍遷峰，230 nm是Zr02八面體結構中Zr-O-Zr產生的吸收峰。但對于制備得到核殼型Zr02/Si02材料，只能看到206 nm的Zr4+ _O2-的電子轉移躍遷吸收峰，沒有230 nm的吸收峰。通過這個數據證明Zr02的確被包覆在Si02表面，且其包覆在Si02表面的Zr02呈高度不飽和的四面體結構。